TERAPIA GÉNICA EN FIBROSIS QUISTICA PULMONAR

Con respecto a la terapia génica de otras enfermedades monogénicas tenemos que en protocolos de tratamiento para la fibrosis quística, utilizando adenovirus administrados al tracto respiratorio en forma de aerosol, ha habido también mejoría parcial de los pacientes, presentándose la respuesta inmune del huésped y una baja eficiencia de los vectores como el principal impedimento en estos tipos de terapia

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TRANSGENICOS RELACIONADOS CON FIBROSIS QUISTICA PULMONAR

Se han realizado estudios en los que el ADN
extraño puede incorporarse a la línea germinal. Con la clonación de los genes fue posible microinyectar el ADN deseado en embriones de ratón. El desarrollo de ratones transgénicos y los transgenes (ADN inoculado a estos ratones) ha sido un avance muy importante en la terapia génica.
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ADN RECOMBINANTE EN FIBROSIS QUISTICA PULMONAR

La tecnología del ADN recombinante ofrece un nuevo camino para investigar las enfermedades genéticas.ADN, que puede ser extraído de cualquier célula nucleada (en nuestro caso, leucocitos de sangre periférica), es digerídocon las enzimas de restricción Taq I, Pst I, Msp I y Ban II, según técnicas ya descritas.^ Tras la separación electroforética en geles de agarosa al 0,8%, los fragmentosde ADN son transferidos a un soporte sólido (nylon o nitrocelulosa), y se híbridan con las sondas met D, met H, XV-2c, KM.19, J3.11 y pT-3 marcadas radioactivamente. Tras la conveniente autorradiografía podrán estudiarse los Fragmentos de Restricción de Longitud Polimórfica (FRLP) que nos permitirán realizar el diagnóstico molecular. 

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ADN RECOMBINANTE EN LA NATURALEZA

Los virus transfieren ADN entre bacterias y entre especies eucariotas, transfieren su material genético durante la infección. Dentro de la célula infectada, los genes se replican y dirigen la síntesis de proteínas virales. Los genes replicados y las nuevas proteínas virales se ensamblan dentro de la célula y forman nuevos virus que,  son liberados para infectar a otras células. Durante muchas infecciones virales, las secuencias del ADN viral se incorpora a uno de los cromosomas de la célula huésped. Este ADN puede permanecer ahí durante días, meses o incluso años. Cuando se producen nuevos virus a partir del ADN incorporado, estos pueden integrar por error genes humanos en el genoma del virus.           

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PRUEBAS MOLECULARES PARA FIBROSIS QUISTICA

Se extrajo ADN de sangre venosa periférica utilizando el método modificado de salting out16 y previa cuantificación de su concentración a 3ng/ul; se guardó el material genético obtenido (ADN) a menos 20°C. Posteriormente, y previa amplificación enzimática o PCR (Polimerase Chain Reaction) de los ADNs, se estudió el gen CFTR por medio de la técnica de heterodúplex para identificar la mutación ∆F508. En los pacientes  homocigotos para  esta mutación se dió por concluido el estudio, mientras que los pacientes que no tuvieron en su genotipo uno o ambos alelos con esta mutación (∆F508) pasaron a la siguiente fase del estudio. En esta etapa se analizaron los ADNs por medio de una técnica de hibridación reversa in situ (test INNO-LiPA CFTR 29+Tn) que identifica las mutaciones.

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MECANISMOS GENÉTICOS MOLECULARES DE LA FIBROSIS QUISTICA

Se han sugerido cinco mecanismos moleculares por los que una mutación produciría una disfunción del canal CFTR: las mutaciones clase I y II suelen asociarse con insuficiencia pancreática (las mutaciones de clase I conducen a una ausencia en la producción de CFTR, y las de clase II no permiten que la proteína alcance la membrana epitelial), mientras que las otras tres clases de mutaciones (III, IV y V) presentan una gran variabilidad en su expresión clínica.

• Mutaciones de Clase I: No producción de la proteína CFTR (la más común: G542X).
• Mutaciones de Clase II: Procesamiento defectuoso de la proteína (DF508, NN1303K,..).
• Mutaciones de Clase III: Regulación defectuosa de canal de cloro (G551D).
• Mutaciones de Clase IV: Transporte defectuoso de la corriente de Cl- (R117H, R334W,...).
• Mutaciones de Clase V: Reducción de la síntesis de ARNm.

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PCR RELACIONADO CON FIBROSIS QUISTICA PULMONAR

El análisis de las mutaciones del CFTR se realizó mediante PCR por 3 métodos: 1) heterodúplex; 2) restricción enzimática y 3) mutagénesis dirigida y restricción enzimática. Las mutaciones analizadas fueron p.PHE508del, p.Gly542X, p.Asn1303Lys, p.Trp1282X, P.Gly551Asp, p.Arg553X, p.Arg1162X, p.Arg334Trp y p.Ile507del, agrupándose en las diferentes clases (I, II, III, IV y V) según el criterio funcional antes mencionado, de modo de obtener dos poblaciones homogéneas para su posterior comparación.

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